Unexpected consequences: exon skipping caused by CRISPR-generated mutations – 논문 리뷰

dijw1412c1 2025. 4. 19.

이번 리뷰에서는 Sharpe와 Cooper가 2017년 Genome Biology에 발표한 논문, “Unexpected consequences: exon skipping caused by CRISPR-generated mutations”를 다룬다. 이 논문은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술이 의도하지 않은 결과로서 엑손 스킵핑(exon skipping)을 유발할 수 있으며, 이로 인해 전사체 및 단백질 수준에서 예기치 않은 표현형이 나타날 수 있음을 보여준다. 특히, 무기능(null) 대립유전자를 생성하려는 목적에도 불구하고 일부 경우에는 기능을 유지하거나 새로운 기능을 가진 단백질이 생성될 수 있어 연구 결과의 해석에 주의가 필요함을 강조한다. 본 리뷰에서는 해당 연구의 배경, 목적, 실험 방식, 주요 발견과 그 함의에 대해 상세히 소개한다.

연구 배경 및 중요성

CRISPR/Cas9 기술은 유전체 내 특정 위치에 이중 가닥 절단(double-stranded break, DSB)을 유도하여 삽입 또는 결실(indel)을 발생시키고, 이를 통해 표적 유전자를 비활성화하는 방식으로 널리 사용되고 있다. 그러나 최근에는 이러한 편집 과정에서 의도하지 않은 결과, 특히 엑손 스킵핑 현상이 자주 관찰된다는 보고가 증가하고 있다. 엑손 스킵핑은 유전자 기능의 소실을 넘어, 새로운 기능을 가진 단백질을 생성할 수 있으며, 이는 생물학적 해석을 왜곡시킬 수 있다. 따라서 이 문제를 인식하고, 유전자 편집의 정확성과 효과를 보장하기 위한 정밀한 품질 관리가 필수적이다.

연구 목적 및 배경

이 논문의 목적은 CRISPR/Cas9 기술을 통해 생성된 변이에서 발생하는 엑손 스킵핑 현상을 체계적으로 보고하고, 그 기전과 빈도, 그리고 발생 시 어떤 영향을 미치는지를 규명하는 데 있다. 연구팀은 실제로 CRISPR를 통해 클론 세포주를 제작하고, RNA 분석을 통해 스플라이싱 패턴 변화를 관찰하였다. 이를 통해 의도한 무기능 대립유전자가 아닌, 기능성 단백질 또는 변형된 단백질이 생성될 수 있다는 가능성을 제기한다.

연구 방법

CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 Kras 유전자의 2번 엑손에 indel 유도
엑손 간 RT-PCR 및 RNA-seq을 통해 스플라이싱 패턴 분석
Ctnnb1(β-catenin) 유전자의 3번 엑손을 타깃으로 다양한 sgRNA 적용
서열 분석과 면역형광염색을 통해 단백질 발현 위치 및 기능 분석
내재적 스플라이싱 요소(ESE/ESS) 분석 및 엑손 결손에 따른 스플라이싱 결과 평가

특히 연구진은 RT-PCR 프라이머를 여러 엑손에 걸쳐 설계함으로써 전체 전사체 구조를 확인하였고, 엑손 간 이음부(junction reads)를 통해 엑손 스킵핑의 발생 여부를 판단하였다.

주요 발견 및 결과

연구 결과, indel이 도입된 Kras 유전자에서 엑손 2가 스킵된 mRNA가 상당량 발견되었고, 이는 기능적 시작 코돈을 포함하지 않아 비정상 단백질을 생성할 수 있었다. 또한 Ctnnb1 유전자에서 엑손 3이 스킵될 경우, 안정화된 활성형 β-catenin 단백질이 생성되어 세포핵에 위치하는 것으로 확인되었다. 일부 경우에서는 CRISPR로 인해 하나의 엑손이 아닌, 여러 엑손이 삭제되면서, 남은 엑손이 스플라이싱되어 단백질이 생성되었다. 이는 단순히 indel이 아니라 예상치 못한 큰 유전체 결실이 발생했음을 시사한다.

실험 결과 요약

타겟 유전자	표적 엑손	관찰된 결과	의미
Kras	엑손 2	엑손 스킵핑 → mRNA 변형	기능 소실 실패
Ctnnb1	엑손 3	엑손 스킵핑 → 핵에 위치한 β-catenin	기능적 단백질 생성
Ctnnb1	복수 엑손	대규모 유전체 결실 및 엑손 스플라이싱	단백질 구조 변화

위 결과는 indel이 단지 프레임시프트를 유도하는 것 외에도, 스플라이싱 패턴 자체에 영향을 미치며 기능적 단백질 생성으로 이어질 수 있음을 보여준다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 논문은 엑손 스킵핑이 다양한 세포주와 유전자에서 발생할 수 있음을 보여주지만, 정확한 예측 모델이 부족하다는 점에서 한계가 있다. 현재로서는 특정 indel이 어떤 스플라이싱 결과를 유도할지 예측하기 어렵다. 향후에는 ESE/ESS 분석 알고리즘의 정교화, AI 기반 스플라이싱 예측 도구 개발, 그리고 다양한 세포 유형과 생체 내 조직에서의 적용 연구가 필요하다. 또한 모든 CRISPR 기반 돌연변이 분석에 있어 RNA 수준의 검증이 필수적이라는 점이 강조된다.

결론

CRISPR/Cas9 시스템을 통해 무기능 유전자를 생성하고자 할 때, 예상치 못한 엑손 스킵핑 현상이 발생하여 기능성 또는 변형된 단백질이 생성될 수 있다는 점은 매우 중요한 발견이다. 본 연구는 단순한 indel 삽입이 스플라이싱 패턴을 변화시키고, 유전자 기능 분석에 큰 영향을 미칠 수 있음을 입증하였다. CRISPR 실험을 수행하는 모든 연구자는 단백질뿐 아니라 mRNA 수준의 정밀 분석을 수행하여 연구 결과의 정확성을 확보해야 한다.

개인적인 생각

이 논문은 CRISPR 기술이 가진 놀라운 가능성뿐 아니라, 그 뒤에 숨어 있는 위험 요소를 적나라하게 보여주는 좋은 예다. 특히 “기능 소실” 유전자를 만들었다고 생각했지만, 실제로는 엑손 스킵핑을 통해 기능을 유지하거나 새로운 기능을 갖는 단백질이 생성된다는 사실은 유전자 편집 연구 전반에 경고를 준다. 단순히 DNA 수준의 확인만으로 결과를 단정 짓는 관행은 재고되어야 하며, RNA 및 단백질 수준의 다중 검증 절차가 필수적이다. 유전체 편집 기술이 더욱 고도화되고 있는 만큼, 생물학적 메커니즘에 대한 깊은 이해와 품질 관리가 동반되어야 할 시점이다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1. CRISPR로 엑손 스킵핑이 왜 발생하나요?
엑손 내 존재하는 스플라이싱 촉진 요소(ESE)가 indel에 의해 손상되거나 억제 요소(ESS)가 유도되어 엑손이 제외되는 스플라이싱이 유도될 수 있습니다.
Q2. 엑손 스킵핑은 얼마나 자주 발생하나요?
Mu et al.의 보고에 따르면, 상당수의 sgRNA가 엑손 스킵핑을 유도할 수 있으며 이는 흔한 현상일 수 있습니다.
Q3. 이러한 문제를 어떻게 피할 수 있나요?
스플라이싱 영향을 고려한 sgRNA 설계와 함께, RNA 수준의 RT-PCR 분석을 통해 생성된 mRNA의 구조를 반드시 확인해야 합니다.
Q4. 모든 세포에서 동일하게 엑손 스킵핑이 발생하나요?
아닙니다. 스플라이싱은 세포 종류나 조직에 따라 달라질 수 있어, 조직 특이적 발현 변화가 나타날 수 있습니다.
Q5. 대규모 유전체 결실은 어떻게 감지하나요?
프라이머 부위 자체가 결실된 경우 PCR로 감지되지 않으므로, 여러 엑손에 걸친 RT-PCR이 더 효과적인 스크리닝 방법입니다.
Q6. 이런 문제가 치료용 유전자 편집에도 영향을 미치나요?
네. 치료 목적의 유전자 편집에서도 예상치 못한 단백질이 생성되면 안전성 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서 품질 관리가 매우 중요합니다.

용어 설명

CRISPR/Cas9: 특정 DNA 서열을 인식하고 절단할 수 있는 유전자 편집 기술.
Exon Skipping: RNA 스플라이싱 과정에서 특정 엑손이 제외되어 mRNA가 생성되는 현상.
Indel: 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 변이.
NMD (Nonsense-Mediated Decay): 프레임시프트로 인해 조기 종료 코돈이 생기면 해당 mRNA를 분해하는 기전.
ESE (Exonic Splicing Enhancer): 스플라이싱 효율을 높이는 엑손 내 염기서열.
ESS (Exonic Splicing Silencer): 스플라이싱을 억제하는 엑손 내 염기서열.
RT-PCR: RNA를 cDNA로 역전사 후 PCR을 수행하는 분석법.
Frameshift Mutation: 코돈의 읽는 틀(reading frame)이 바뀌는 변이로, 보통 단백질 기능 상실을 유도.
sgRNA (Single Guide RNA): CRISPR 시스템에서 Cas9을 표적 유전자에 유도하는 RNA.
Large Genomic Deletion: 예상보다 큰 범위의 DNA가 결실되는 현상으로, 엑손 여러 개가 사라질 수 있다.