The continuously evolving CRISPR barcoding toolbox - 논문 리뷰

본 리뷰 논문은 최근 발표된 두 가지 혁신적인 CRISPR 기반 세포 바코딩 기술을 중심으로, 발생생물학과 세포 추적 분야에서의 적용 가능성과 그 한계에 대해 다룬다. Gaj와 Perez-Pinera는 두 개의 주요 연구 결과를 소개하며, 각각의 기술이 어떻게 기존의 세포 계통 추적 방식보다 발전된 형태로 세포의 유전적 이력을 기록하고 해석할 수 있는지를 설명한다. Kalhor 등은 자기지시형 sgRNA(hgRNA)를 통해 세포 내에서 지속적으로 유전적 바코드를 생성하는 시스템을 마우스 모델에 적용하였고, Halperin 등은 진화형 CRISPR 플랫폼인 EvolvR을 통해 사용자가 정의한 염기 서열 범위 내에서 연속적이고 다양한 돌연변이를 유도할 수 있는 가능성을 입증하였다. 이 두 시스템은 세포 발생 경로를 보다 정밀하게 추적하고, 단일 세포 수준에서 유전자 기능을 규명할 수 있는 도구로 발전하고 있으며, 미래에는 질병 모델링, 유전자 치료, 합성생물학 등의 다양한 분야에서 활용될 수 있을 것으로 보인다.

연구 배경 및 중요성

우리 몸은 약 37조 개 이상의 세포로 구성되어 있으며, 이들 각각은 발생 과정 중 특정 계통을 따라 분화된다. 그러나 복잡한 세포 분화와 발생 경로를 완벽하게 추적하는 것은 기술적 한계로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있다. 특히 포유류 발생 초기 단계에서 세포의 계통을 추적하는 것은 어류나 파충류보다 훨씬 복잡하다. 이러한 복잡성을 해결하기 위한 하나의 접근법으로, 유전자 편집 기술을 통해 세포 내에서 자체적으로 고유한 유전자 바코드를 생성하고, 이를 시퀀싱을 통해 읽어내는 방식이 제안되었다. 본 논문은 이러한 세포 추적을 가능하게 하는 CRISPR 기반 기술들의 발전을 정리하고, 새로운 가능성을 제시한다.

연구 목적 및 배경

이 논문의 목적은 최근 발표된 두 가지 세포 바코딩 기술인 Kalhor 등 연구의 자기지시형 hgRNA 시스템과 Halperin 등의 EvolvR 기술을 비교 분석함으로써, 각 기술의 원리와 장단점, 그리고 발생생물학에 미칠 수 있는 잠재적 영향을 조명하는 것이다. 기존에는 NHEJ에 의한 무작위 돌연변이 생성 방식이 바코딩의 핵심이었으나, 이는 한정된 다양성 문제와 분석의 복잡성을 초래하였다. 이 문제를 해결하고 보다 정교한 바코드 생성 및 활용을 가능하게 하기 위해 두 기술이 제안되었다.

연구 방법

• Kalhor 등: hgRNA를 포함한 MARC1 마우스 모델 생성 후 Cas9 발현 마우스와 교배
• CRISPR-Cas9 자기지시형 시스템을 활용하여 세포 자체적으로 바코드 생성
• 고속 시퀀싱으로 생성된 바코드를 읽어 세포 계통 트리 구성
• Halperin 등: nCas9을 변형한 EvolvR 시스템 설계
• 오류 유도 DNA 중합효소와 결합하여 넓은 범위에서 지속적 돌연변이 유도

Kalhor 연구팀은 41개의 서로 다른 hgRNA 발현 카세트를 갖는 마우스를 제작하여, 세포 내에서 Cas9이 hgRNA를 반복적으로 타겟팅하며 바코드를 생성하도록 하였다. Halperin 연구팀은 Cas9 닉가제를 기반으로 하는 EvolvR 시스템을 통해 오류 유도 중합효소를 특정 유전체 부위에 유도하고, 유전자의 특정 창(window) 내에서 무작위 돌연변이를 유도하는 방식을 개발하였다.

주요 발견 및 결과

Kalhor 연구에서는 MARC1 마우스를 통해 동일 계통의 세포가 유사한 바코드를 공유함을 입증하였으며, 마우스 배아 초기의 계통 트리를 성공적으로 재구성하였다. 그러나 hgRNA의 길이나 삽입 위치에 따라 활성이 달라지는 문제, NHEJ에 의한 바코드 다양성 부족 등의 한계가 존재하였다. 반면, Halperin의 EvolvR는 넓은 범위에서 고도의 무작위성을 가지는 변이를 유도할 수 있어 이론적으로 더 다양하고 정교한 바코드 생성이 가능하다. 또한 다중 타겟팅이 가능하여 복잡한 유전 경로를 동시에 분석할 수 있는 장점이 있다.

실험 결과 요약

비교 항목	Kalhor 등 (hgRNA 시스템)	Halperin 등 (EvolvR 시스템)
바코드 생성 원리	자기지시형 sgRNA + Cas9에 의한 NHEJ 돌연변이	nCas9 + 오류 유도 DNA 중합효소
무작위성	제한적	매우 높음
다중 타겟 가능성	제한적	높음
동물 모델 적용 여부	적용 완료 (마우스)	아직 박테리아에만 적용

두 시스템 모두 고유한 강점을 가지며, Kalhor의 시스템은 이미 생체 내에서 적용되어 실제 세포 계통을 추적한 반면, EvolvR는 더 높은 다양성과 확장성을 제공하지만 아직 포유류 시스템에서의 적용은 입증되지 않았다.

한계점 및 향후 연구 방향

Kalhor 시스템은 삽입 위치와 hgRNA의 차이에 따라 바코드 생성의 예측 가능성이 떨어지는 문제가 있으며, NHEJ 기반의 돌연변이 생성 자체가 한정적인 다양성만을 제공하는 단점이 있다. 반면 EvolvR는 박테리아 시스템에서만 입증되었기 때문에 포유류 세포에서의 독성, 돌연변이 축적에 따른 생존율 저하 등은 향후 해결이 필요한 과제다. 또한 EvolvR의 고도 무작위성은 분석 측면에서 새로운 계산 생물학적 접근을 요구할 것으로 보인다.

결론

본 논문은 CRISPR 기반의 두 가지 선도적인 세포 바코딩 기술을 조명하며, 세포 계통 추적과 유전자 기능 분석의 패러다임 전환을 시사한다. hgRNA 기반 시스템은 이미 생체 내에서 세포 바코드 기록에 성공하였고, EvolvR는 보다 확장된 바코드 다양성과 유연성을 제공할 수 있다. 향후 이 기술들이 포유류에 적용되고, 독성과 안전성이 해결된다면 발생학, 질병 모델링, 합성생물학 등의 광범위한 분야에서 활용될 수 있을 것이다.

개인적인 생각

두 기술 모두 매우 혁신적이며, 각각 현실 적용성과 기술적 가능성 측면에서 상호 보완적인 특성을 가지고 있다고 생각된다. 특히 Kalhor의 시스템은 제한적 다양성을 여러 바코드를 조합해 극복한 점이 인상 깊으며, 실질적인 발생 생물학 연구에 기여할 수 있는 수준에 도달해 있다. EvolvR는 기술적으로 더 큰 확장 가능성을 가지고 있지만, 이를 실제로 활용하기 위해서는 포유류 세포에서의 안전성, 정밀 제어 가능성 등 많은 과제가 남아 있다. 하지만 이처럼 유전자 편집 기술이 세포 계통 추적이라는 고전적인 생물학적 문제를 해결할 수단으로 진화하고 있다는 점은, 생명과학 연구의 미래가 얼마나 무한한 가능성을 가지는지를 잘 보여준다.

자주 묻는 질문 (QnA)

• Q1: hgRNA란 무엇인가요?
  A: 일반 sgRNA와 달리 PAM 서열까지 포함하고 있어 Cas9이 자기 자신을 타겟팅하게 만드는 자기지시형 가이드 RNA입니다.
• Q2: EvolvR는 어떻게 작동하나요?
  A: nCas9에 오류 유도 중합효소를 결합하여, 특정 유전자 영역에서 무작위 변이를 유도합니다.
• Q3: Kalhor 시스템은 실제 동물에 적용되었나요?
  A: 네, 마우스에 적용되어 배아 발생 초기의 계통 트리 재구성에 성공했습니다.
• Q4: EvolvR는 아직 포유류에서 실험된 적이 없나요?
  A: 아직 박테리아에서만 실험되었으며, 포유류 적용은 향후 연구 과제입니다.
• Q5: 왜 바코드 다양성이 중요한가요?
  A: 각 세포를 구별할 수 있어야 세포 계통을 정확히 추적할 수 있기 때문입니다.
• Q6: 이 기술이 질병 연구에도 활용될 수 있나요?
  A: 네, 유전자 돌연변이 누적 패턴을 분석하여 질병의 원인과 진행 경로를 추적하는 데 활용될 수 있습니다.

용어 설명

• CRISPR-Cas9: 특정 DNA 서열을 인식해 절단할 수 있는 유전자 편집 도구입니다.
• hgRNA (Homing guide RNA): Cas9에 의해 자기 자신이 타겟팅되도록 구성된 가이드 RNA입니다.
• NHEJ (Non-homologous end joining): DNA 이중가닥 절단 후 비동질 말단 접합을 통해 복구되는 과정입니다.
• sgRNA (Single guide RNA): Cas9을 목표 DNA로 유도하는 RNA 서열입니다.
• nCas9 (Nickase Cas9): DNA의 한 가닥만 절단하는 Cas9의 변형체입니다.
• DNA 중합효소: DNA 복제를 담당하는 효소로, EvolvR에서는 오류 유도 기능을 가짐
• 바코딩(barcoding): 세포마다 고유한 유전적 표식을 부여해 계통을 추적하는 기술입니다.
• Multiplexing: 여러 유전자나 서열을 동시에 타겟팅하는 기능입니다.
• Directed evolution: 인위적인 돌연변이 유도를 통해 유전자의 기능을 최적화하는 기법입니다.
• Saturation mutagenesis: 유전자 전체에 걸쳐 가능한 모든 돌연변이를 유도하는 실험 방법입니다.