Pop in, pop out: CRISPR-Cas9을 이용한 새로운 유전자 타겟팅 전략

dijw1412c1 2025. 4. 22.

본 블로그 포스트에서는 Kühn과 Chu가 2015년 Genome Biology에 발표한 논문 "Pop in, pop out: a novel gene-targeting strategy for use with CRISPR-Cas9"를 리뷰합니다. 이 논문은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유전자 편집 기술의 정밀성과 효율성을 향상시키기 위한 새로운 2단계 전략인 'pop in & pop out' 방식을 제안하며, 특히 낮은 HDR 빈도로 인해 어려움을 겪는 경우에도 정확한 변이체를 획득할 수 있는 효과적인 대안을 제공합니다. 유전자 삽입 후 형광 마커를 삽입했다가 다시 제거할 수 있는 이 기술은 기존 CRISPR-Cas9 기반 유전자 타겟팅 기술의 한계를 극복하고, 실험 동물 모델 및 인간 세포주에서 보다 세밀한 기능적 유전자 분석을 가능하게 합니다.

연구 배경 및 중요성

CRISPR-Cas9 시스템은 세포 내 특정 DNA 서열에 이중 가닥 절단(double-strand break, DSB)을 유도하여 비동일 말단 연결(NHEJ) 또는 상동 재조합(HDR) 복구 메커니즘을 통해 유전자를 편집할 수 있도록 하는 강력한 유전자 편집 기술입니다. 하지만 특히 HDR 기반의 노크인(knock-in) 전략은 낮은 효율과 복잡한 절차로 인해 실험적 제약이 따릅니다. 특히 정확한 유전자 변형이 필요한 경우, 많은 수의 클론을 선별해야 하고, 마커를 삽입하는 경우 불필요한 유전자 흔적이 남을 수 있습니다. 본 논문에서는 이를 극복하기 위한 'pop in & out' 전략을 제시하며, 유전자 마커의 삽입과 제거를 통해 정밀하고 흔적 없는 유전자 편집을 가능하게 하는 접근법을 설명합니다.

연구 목적 및 배경

본 논문의 주된 목적은 기존의 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기법에서 마주치는 낮은 HDR 효율성과 불필요한 마커 삽입의 문제를 해결할 수 있는 새로운 유전자 타겟팅 전략을 개발하는 것이었습니다. 저자들은 이를 위해, 두 단계로 이루어진 'pop in & out' 전략을 고안하였으며, telomerase reverse transcriptase (TERT) 유전자에 N-말단 태그를 삽입하거나, 단일 염기 변이를 도입하는 실험을 통해 그 가능성과 실용성을 입증했습니다.

연구 방법

‘Pop in’ 단계: 표적 유전자 좌위에 HDR을 통해 형광 단백질(GFP)과 태그를 삽입
FACS를 통한 GFP 양성 세포군 선별 및 클론 확립
‘Pop out’ 단계: Cre 또는 sgRNA를 이용해 GFP 마커 제거
GFP 음성 세포를 다시 FACS로 선별하여 최종 변이체 획득
추가 실험으로 단일 염기 변이 삽입(SNP) 후 완전한 마커 제거 시도

이 방식은 처음에 유전자 내 특정 위치에 GFP 마커를 포함한 유전자 태그를 삽입하고(FACS로 선별), 이후 Cre 재조합효소 혹은 sgRNA 쌍을 통해 마커를 제거함으로써, 정확한 편집만 남기고 외래 유전자 마커는 제거할 수 있도록 설계되었습니다. 이를 통해 흔적 없이 유전자 편집이 가능하며, 불필요한 반복 유전자를 최소화할 수 있습니다.

주요 발견 및 결과

‘Pop in’ 단계에서 TERT 유전자에 N-말단 태그를 삽입한 후, 전체 FACS-enriched GFP+ 클론 중 84%가 실제로 정확한 HDR에 의한 표적 삽입을 갖고 있음을 확인하였습니다. 이어지는 ‘Pop out’ 단계에서는 Cre 재조합효소를 통해 GFP 마커를 제거했으며, 모든 GFP- 클론에서 마커가 완전히 제거된 것을 확인했습니다. 또한 단일 염기 변이를 삽입한 실험에서도 두 번째 sgRNA 쌍과 함께 마커 제거를 성공시켜, 흔적 없이 원하는 SNP만을 남기는 데 성공했습니다.

실험 결과 요약

실험 항목	결과
TERT 유전자에 N-말단 태그 삽입 (pop-in)	HDR을 통한 삽입 성공률 84%
GFP 마커 제거 (pop-out, Cre 사용)	GFP- 클론 모두에서 마커 제거 성공
단일 염기변이(SNP) 삽입 실험	GFP와 함께 SNP 삽입 후 마커 제거 성공
sgRNA 이용한 마커 제거	마커 제거 및 SNP 보존 성공

이러한 결과는 두 단계 방식이 높은 정확성과 반복 가능성을 갖춘 유전자 편집 전략임을 보여줍니다.

한계점 및 향후 연구 방향

두 단계 전략은 HDR이 필요한 모든 유전자 편집 상황에 적용 가능하나, 두 번의 벡터 설계와 클론 분리 과정이 요구되어 시간이 더 소요된다는 단점이 있습니다. 특히 Cre에 의한 loxP 잔여 염기서열이 남는 경우가 있고, sgRNA를 활용한 제거법은 GFP 침묵 표현(silencing)에 의해 FACS 선별의 정확도가 낮아질 수 있습니다. 향후 연구에서는 NHEJ 억제제와의 병용, S기 타이밍 기반 전달 전략과의 통합 등을 통해 효율 향상을 기대할 수 있습니다.

결론

본 논문은 CRISPR-Cas9을 이용한 유전자 편집에 있어 마커 삽입 후 제거가 가능한 두 단계 전략을 제시하여, HDR 기반의 정확한 유전자 변형을 보다 실용적이고 정밀하게 수행할 수 있는 방법론을 제공하였습니다. 특히 마커 유전자의 흔적을 남기지 않고 유전자 편집이 가능하다는 점에서 실험적 유연성과 응용 가능성을 크게 높인 연구로 평가됩니다.

개인적인 생각

CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 있어 이미 획기적인 도구로 자리잡았지만, 여전히 '정확성'과 '효율성'이라는 난제를 완전히 해결하지는 못했습니다. Kühn과 Chu의 이 연구는 그런 문제를 실질적으로 해결할 수 있는 전략을 제시했다는 점에서 매우 중요합니다. 특히 세포 실험에서 흔히 필요한 마커 유전자의 삽입과 제거를 별도의 벡터와 단계를 통해 깔끔하게 수행할 수 있도록 설계한 점이 인상적입니다. 마커를 제거한 후에도 원하는 유전자 변형이 보존되는 구조는 실제 생체 내 적용 및 치료 전략에서도 활용 가능성이 높다고 생각합니다. 유전자를 '수정하고 정리한다'는 이 전략은 단순하지만 강력한 개념이며, 앞으로 다양한 분야에서 응용될 수 있을 것입니다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1: ‘pop in & pop out’ 전략이란 무엇인가요?
A1: 유전자 편집 시 형광 마커를 일시적으로 삽입(pop in)하고, 후에 제거(pop out)하는 2단계 HDR 기반 전략입니다.
Q2: 왜 마커를 제거해야 하나요?
A2: 외래 유전자 마커가 유전체에 남을 경우, 후속 연구나 치료 응용 시 불필요한 변이로 작용할 수 있기 때문입니다.
Q3: HDR과 NHEJ의 차이는 무엇인가요?
A3: HDR은 정확한 DNA 복구 방식이며, NHEJ는 무작위 삽입/결실을 유발하는 불안정한 방식입니다.
Q4: Cre 재조합효소는 어떤 역할을 하나요?
A4: loxP 사이에 위치한 유전자 마커를 제거하여 마커 없이 변이만 남도록 하는 효소입니다.
Q5: GFP 마커가 침묵화(silencing)되면 어떤 문제가 생기나요?
A5: GFP 발현이 감소하면 FACS로 정확히 양성 클론을 선별하기 어렵게 되어 효율이 떨어질 수 있습니다.
Q6: 이 전략은 어떤 분야에서 활용될 수 있나요?
A6: 기초 생명과학 연구는 물론, 세포 치료, 유전자 교정 치료 등 다양한 분야에서 활용될 수 있습니다.

용어 설명

CRISPR-Cas9: 특정 DNA 서열을 절단하는 유전자 편집 기술
HDR: Homology-directed repair, 상동 재조합을 통해 정확한 유전자 복구 수행
NHEJ: Non-homologous end joining, 무작위적 DNA 연결로 불안정한 변이 유도
sgRNA: Single guide RNA, Cas9을 특정 DNA 위치로 유도하는 RNA
DSB: Double-strand break, DNA 이중 가닥 절단
FACS: Fluorescence-activated cell sorting, 형광을 이용한 세포 선별 기술
GFP: Green fluorescent protein, 형광 마커로 사용되는 단백질
loxP: Cre 효소에 의해 인식되어 재조합을 유도하는 DNA 서열
Cre recombinase: loxP 염기서열 사이의 유전자를 제거하는 효소
SNP: Single nucleotide polymorphism, 단일 염기 서열 변이