Matrix-free human 2D organoids recapitulate duodenal barrier and transport properties - 인간 2D 오가노이드의 장벽 및 수송 기능 재현

dijw1412c1 2025. 4. 7.

본 논문은 인간 십이지장에서 유래한 3차원(3D) 오가노이드를 단일 세포 수준에서 분해한 후, 젤라틴 기질(BME) 없이 2차원(2D)으로 배양해 장 상피의 장벽 및 수송 기능을 재현한 연구를 다룹니다. 기존에는 BME 같은 동물 유래 기질이 세포 부착을 위한 필수 요소로 여겨졌지만, 이 기질이 확산 장벽으로 작용할 가능성이 있으며 재현성과 동물윤리 문제를 야기합니다. 이에 저자들은 BME 없이도 안정적으로 단층 배양이 가능한 오가노이드 시스템을 개발하고, 다양한 생리학적 기능을 정량적으로 분석했습니다. 특히, 세포 분극, 타이트 정션 형성, 영양소 흡수, 이온 수송, 염증 유도 투과성 변화 등 주요 기능들을 BME 코팅 유무에 따라 비교하였고, 그 결과 BME-free 시스템이 동등하거나 오히려 더 뛰어난 기능을 보임을 입증했습니다. 이 연구는 장 상피 모델에서의 동물 유래 성분 제거를 통해, 인간 관련성 및 윤리적 기준을 높이는 방향으로 중요한 진전을 이룹니다.

연구 배경 및 중요성

소장은 병원균의 침입을 차단하고 영양분을 선택적으로 흡수하는 중요한 생리적 장벽입니다. 그러나 기존의 세포주 기반 모델이나 동물 모델은 이 기능을 완벽히 재현하지 못하며, 특히 인간과의 생리적 차이 및 세포 구성의 다양성 부족이라는 한계가 있습니다. 오가노이드 기술은 이러한 문제를 해결하기 위한 혁신적 접근법으로, 조직 유래 줄기세포를 기반으로 다양한 세포 유형을 포함한 장기 모사 모델을 구축할 수 있게 되었습니다. 하지만 이들 대부분은 젤라틴 기질에 의존하며, 이는 실험 간 재현성과 인간 적용 가능성 측면에서 제약을 줍니다. 따라서 본 연구는 BME 없는 2D 오가노이드 단층이 실제 십이지장 기능을 얼마나 잘 재현할 수 있는지를 평가하는 데에 집중하였습니다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 목적은 인간 십이지장에서 유래한 오가노이드를 기반으로, BME 없이도 안정적으로 성장하고 기능적으로 성숙한 2D 단층 배양 시스템을 확립하는 것입니다. 이 시스템은 장벽 기능, 영양소 흡수, 이온 수송, 염증 반응 등 십이지장 특유의 생리학적 기능을 반영해야 하며, 기존의 BME 코팅 시스템과 비교하여 그 성능을 입증해야 합니다. 또한, 이 연구는 오가노이드 배양에서 동물성 성분을 제거함으로써, 3Rs 원칙(동물실험의 대체, 감소, 정제)을 실현하는 데 기여하고자 합니다.

연구 방법

3D 오가노이드를 십이지장 조직에서 유래하여 배양하고, 단일 세포 수준으로 분해
BME 유무에 따라 Transwell에 세포를 접종하여 2D 단층 오가노이드 생성
TER 측정을 통해 장벽 형성 정도를 평가
RT-qPCR 및 면역형광 염색으로 세포 유형 및 타이트 정션 단백질 확인
Ussing 챔버 실험을 통해 이온 수송, 포도당 흡수, SCFA 흡수 분석
TNF-α를 처리하여 염증 조건 하에서의 투과성 변화 측정

이러한 방법을 통해 BME-free 오가노이드 단층이 장 상피의 기능적 특성을 얼마나 잘 재현하는지를 구조적, 분자적, 기능적으로 종합 분석했습니다.

주요 발견 및 결과

BME 없이 배양된 오가노이드 단층은 BME를 사용할 때와 유사하게 성장하고, 세포 분극과 타이트 정션을 형성하며, 주요 장 상피 세포 유형(흡수세포, 파네트 세포, 술잔세포 등)을 포함하는 것으로 확인되었습니다. 기능적으로는 포도당과 SCFA 흡수, 클로라이드 분비, TNF-α에 의한 장벽 투과성 증가 등 인간 십이지장 특유의 생리 반응을 보여주었습니다. 특히 BME-free 조건에서는 염소 분비가 더 활발하게 일어났으며, 이는 BME가 수송에 물리적 방해를 줄 수 있다는 점을 시사합니다.

실험 결과 요약

실험 항목	BME-Coated	BME-Free
TER (Day 14)	326.3 ± 12.5 Ω∙cm²	255.3 ± 4.2 Ω∙cm²
포도당 유도 전류 증가	12.2~19.3 µA/cm²	12.3~19.3 µA/cm²
포스콜린 유도 Cl⁻ 분비	29.7~57.3 µA/cm²	49.6~70.4 µA/cm²
TNF-α 유도 투과성 증가	FD4 및 HRP 투과 증가	유사한 투과성 증가

표에서 알 수 있듯이, 기능적 차이는 크지 않으며 오히려 일부 기능에서는 BME-free 시스템이 우수한 반응을 보였습니다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 시스템은 단층 형성과 기능적 완성도 면에서 매우 우수하지만, 현재까지는 연속적인 계대배양(passaging)이 어려운 것으로 나타났습니다. 이는 세포가 대부분 분화된 상태이며 줄기세포 유지 요소(Wnt 등)가 배양 배지에 없기 때문입니다. 향후 연구에서는 BME-free 조건에서도 장기 배양과 계대가 가능한 시스템 개발이 필요하며, 더 다양한 약물 반응, 미생물과의 상호작용, 염증성 장질환 모델 등으로의 확장도 기대됩니다.

결론

본 연구는 인간 유래 십이지장 오가노이드에서 BME 없이도 기능적 단층을 형성할 수 있음을 실험적으로 입증하며, 기존 모델의 단점을 극복할 수 있는 새로운 표준을 제시합니다. 이는 장벽 기능 연구의 정밀성과 재현성을 향상시키며, 동시에 동물 사용을 줄이는 방향으로 기여하는 중요한 전환점이 될 수 있습니다.

개인적인 생각

이 연구는 단순한 기술 최적화를 넘어, 인간 생리학을 더욱 정확히 반영할 수 있는 장모델 구축이라는 면에서 큰 의미를 가집니다. 특히 BME-free 시스템의 안정적인 TER 유지와 다양한 이온 및 영양소 수송 반응은 기존 장 세포주 모델에서는 보기 어려운 고유한 기능성입니다. 연구자들은 높은 세포 밀도와 Rho kinase 억제를 통해 초기 세포 생존률을 높이는 전략을 사용했고, 이를 통해 기질 없이도 세포들이 안정적으로 부착하고 증식할 수 있는 환경을 만들었습니다. 다만 계대배양이 어렵다는 점은 실용성 면에서 보완이 필요하지만, 현재까지 발표된 어떤 시스템보다도 인간 십이지장의 물리적, 생리적 특성을 종합적으로 반영한 모델이라는 점에서 연구 및 산업계에 큰 영향을 줄 수 있으리라 생각됩니다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1: BME 없이도 세포가 왜 잘 부착되나요?
A1: 고밀도로 세포를 접종하고, Rho kinase 억제제를 이용해 세포 사멸을 줄였기 때문에 BME 없이도 세포 간 상호작용으로 안정적인 부착이 가능해졌습니다.
Q2: 기존의 세포주(Caco-2 등)와 어떤 점에서 다르나요?
A2: 오가노이드는 실제 십이지장처럼 다양한 세포 유형을 포함하며, 세포 분극성과 정교한 수송 기능을 더 잘 재현합니다.
Q3: 이 모델은 장기 배양이 가능한가요?
A3: 일정 기간(수 주) 동안 TER가 안정적으로 유지되지만, 연속적인 계대배양은 아직 불가능합니다.
Q4: 약물 흡수 실험에 사용될 수 있나요?
A4: 네, 포도당과 SCFA 흡수 실험에서 유의미한 반응을 보였으며, 약물 투과도 측정에도 활용될 수 있습니다.
Q5: 왜 BME는 문제가 되나요?
A5: BME는 마우스 종양 유래 물질로, 재현성이 떨어지고 인간 생리와 차이가 있으며, 윤리적 문제도 있습니다.
Q6: 이 모델은 염증성 장질환 연구에도 쓸 수 있나요?
A6: TNF-α에 대한 반응 실험을 통해 염증 조건에서도 유효한 반응을 보이므로, 장염 등 관련 질환 연구에 적용 가능합니다.

용어 설명

오가노이드(Organoid): 조직 유래 줄기세포로부터 3D 혹은 2D로 형성된 미니 장기 모사 모델
BME(Basement Membrane Extract): 젤라틴 형태의 기질로 세포 부착을 돕는 동물 유래 물질
TER(Transepithelial Electrical Resistance): 상피세포 단층의 전기저항으로 장벽 기능을 수치화한 지표
Ussing 챔버: 세포 단층 양쪽에 전극을 연결해 이온 흐름을 측정하는 장치
ISC(Short-circuit current): 전기적 단락 상태에서 흐르는 전류로, 이온 수송 활성도를 나타냄
SCFA(Short Chain Fatty Acid): 짧은 사슬 지방산으로, 장내 미생물에 의해 생성되어 장 상피에서 흡수됨
TNF-α(Tumor Necrosis Factor-alpha): 염증을 유도하는 사이토카인으로, 장벽 파괴에 관여
Phlorizin: 포도당 수송 억제제
Forskolin: cAMP 증가를 유도해 CFTR을 통한 염소 이온 분비를 자극하는 물질
TrypLE: 세포 분리에 사용되는 비동물성 효소로, 기존 트립신의 대안