Heterologous and endogenous U6 snRNA promoters enable CRISPR/Cas9 mediated genome editing in Aspergillus niger

dijw1412c1 2025. 4. 13.

이번 리뷰에서는 Zheng 등(2018)이 Fungal Biology and Biotechnology에 발표한 논문 "Heterologous and endogenous U6 snRNA promoters enable CRISPR/Cas9 mediated genome editing in Aspergillus niger"를 다룬다. 본 연구는 산업적으로 중요한 균주인 Aspergillus niger에서 CRISPR/Cas9 시스템을 보다 효율적이고 간단하게 활용하기 위한 방안을 제시한다. 특히, sgRNA 발현을 위한 U6 snRNA 프로모터의 효율성을 검증하여, 기존 RNA polymerase II 기반 시스템이 가진 복잡한 벡터 제작과정 및 낮은 효율 문제를 극복하고자 하였다. 이를 위해 A. niger의 고유 U6 프로모터와 인간 및 효모에서 유래한 이종 U6 프로모터를 비교 분석하였고, 짧은 마이크로 상동팔(micro-homology arm)을 가진 donor DNA를 이용한 유전자 삽입 실험을 통해 이 시스템의 적용 가능성을 입증하였다.

연구 배경 및 중요성

Aspergillus niger는 시트르산, 글루콘산 등의 유기산 및 다양한 산업용 효소를 생산하는 데 널리 활용되는 미생물이다. 그러나 이 균에 대한 유전학적 조작 도구는 여전히 제한적이며, 특히 유전자 기능 분석이나 대사경로 재설계에 필요한 정밀한 유전자 편집이 어렵다는 점이 문제였다. CRISPR/Cas9 시스템은 이러한 한계를 극복할 수 있는 강력한 도구이나, A. niger에서는 sgRNA 발현 시스템이 복잡하고 효율이 낮아 실용화에 장애가 되어왔다. 본 연구는 U6 프로모터 기반 sgRNA 발현 시스템을 A. niger에 적용하여, 보다 단순하고 효율적인 유전체 편집 시스템을 개발하는 데 그 의의가 있다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 주요 목적은 A. niger에서 CRISPR/Cas9 시스템의 효율성과 편의성을 향상시키기 위해, 내인성과 이종성 U6 snRNA 프로모터를 이용한 sgRNA 발현 시스템을 구축하고 이를 기능적으로 검증하는 것이다. 아울러, 짧은 상동팔(40-bp)을 가지는 donor DNA가 Cas9에 의해 유도된 double-strand break(DSB)를 기반으로 한 정확한 유전자 삽입을 가능하게 하는지를 확인하고자 하였다.

연구 방법

A. niger에서 사용 가능한 내인성(anU6) 및 이종성(hU6, yU6) U6 프로모터를 선택하고, 이를 이용한 sgRNA 발현 벡터 제작
albA 유전자를 타깃으로 한 sgRNA 제작 및 Cas9 발현 플라스미드(pCas9)와 공동형질전환
albA 유전자 결손 변이 확인을 위한 형질전환체 분석 및 PCR 기반 진단
Cas9의 핵내 위치 확인을 위한 GFP 융합 단백질 형광 현미경 분석
40-bp 마이크로 상동팔을 가진 donor DNA(MHi-albA-hph)를 이용한 유전자 삽입 실험
qRT-PCR을 이용한 sgRNA 발현 수준 정량 분석

연구팀은 pCas9 벡터를 통한 Cas9 발현, 세 가지 U6 프로모터에 기반한 sgRNA 발현, albA 유전자 변형 여부 확인을 위한 진단 PCR, 그리고 형질전환 효율 평가를 통해 각각의 시스템을 비교하였다. 특히, 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 Cas9을 이용해 핵 내 위치를 확인하였다.

주요 발견 및 결과

연구 결과, 세 가지 U6 프로모터는 모두 A. niger에서 기능적으로 sgRNA를 발현시키고 Cas9에 의한 유전자 절단을 유도할 수 있음을 입증하였다. albA 유전자 타깃 실험에서 변이 개체(albino colony) 생성 비율은 각각 15% (PhU6), 20% (PyU6), 23% (PanU6)로 나타났으며, 내인성 프로모터(anU6)의 sgRNA 발현량은 외래 프로모터 대비 현저히 높았다. 또한 40-bp 짧은 상동팔을 가진 donor DNA를 이용해 albA 유전자에 hph marker를 정확히 삽입하는 데 성공하였으며, 전체 형질전환체 중 36%가 정확한 삽입을, 79%가 albA 변이를 보였다.

실험 결과 요약

U6 프로모터	sgRNA 발현량 (상대치)	albA 변이 비율	정확한 삽입 비율
PhU6 (인간)	1배 (기준)	15% (4/27)	-
PyU6 (효모)	6.09배	20% (1/5)	-
PanU6 (A. niger)	43.76배	23% (3/13)	36% (5/14)

표에 나타난 바와 같이 내인성 U6 프로모터를 사용할 경우, sgRNA 발현량과 변이 비율 모두 우수하였다. 짧은 상동팔을 사용한 유전자 삽입은 기존의 긴 상동팔보다 훨씬 간편하면서도 높은 효율을 나타내었다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 연구는 A. niger에서 간단하고 효율적인 CRISPR 시스템을 확립하였지만, 여전히 몇 가지 한계가 존재한다. 첫째, 변이된 형질전환체 중 일부에서 예상치 못한 크기의 삽입/결실 변이가 발생하였으며, 이는 정확한 유전체 조작을 방해할 수 있다. 둘째, 본 시스템이 다른 유전자 또는 다른 Aspergillus 종에 일반화 가능한지는 추가적인 검증이 필요하다. 향후에는 off-target 분석, 고속 유전자 기능 분석 플랫폼과의 통합, 산업적 균주에의 적용 가능성 등을 평가하는 연구가 이어져야 한다.

결론

본 연구는 A. niger에서 CRISPR/Cas9 시스템을 보다 단순하고 효율적으로 구현하기 위한 새로운 접근법을 제시하였다. 특히 U6 프로모터 기반 sgRNA 발현 시스템은 복잡한 리보자임 처리 없이도 유전자 편집이 가능하며, 짧은 상동팔을 가진 donor DNA로도 정밀한 유전자 삽입이 가능함을 입증하였다. 이 시스템은 A. niger의 기능유전체학 연구뿐 아니라 산업적 활용 가능성에서도 큰 기여를 할 수 있을 것이다.

개인적인 생각

CRISPR 시스템이 다양한 미생물에서 빠르게 확장되고 있는 가운데, 본 논문은 산업 미생물에서 유용한 적용 사례를 매우 체계적으로 제시하고 있다. 특히 기존의 RNA polymerase II 기반 sgRNA 발현 방식이 가진 복잡함을 극복하고, 유전자 삽입 시 상동팔 길이를 획기적으로 줄인 점이 매우 인상 깊었다. 이는 곧 고속 대량의 유전자 스크리닝을 가능하게 하는 기반 기술로 활용될 수 있다. A. niger 뿐 아니라 다른 filamentous fungi로의 확장이 가능하다면, 산업 균주의 재설계와 대사공학적 개량에 매우 유용할 것으로 기대된다. 실험적 재현성도 높고, 방법론적으로도 단순화되어 있어 후속 연구를 위한 훌륭한 토대를 마련해 준 연구라고 생각한다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1: U6 프로모터가 왜 중요한가요?
A1: U6 프로모터는 RNA polymerase III에 의해 작동되며 sgRNA를 정확하게 전사할 수 있어 CRISPR 시스템에서 필수적입니다.
Q2: A. niger에서 기존 sgRNA 발현 방식의 문제점은 무엇이었나요?
A2: RNA polymerase II 기반 시스템은 리보자임 처리가 필요하고, sgRNA의 안정성과 정확성이 떨어지는 문제가 있었습니다.
Q3: albA 유전자는 왜 타깃 유전자로 선택되었나요?
A3: albA 유전자의 돌연변이는 검은색 포자에서 흰색(albino) 포자로 바뀌어 시각적으로 변화를 쉽게 확인할 수 있기 때문입니다.
Q4: 짧은 상동팔(40-bp)로도 유전자 삽입이 가능한 이유는?
A4: Cas9에 의해 유도된 DSB가 HR 경로를 촉진하기 때문에, 짧은 상동팔만으로도 효율적인 삽입이 가능합니다.
Q5: 실험에서 GFP는 어떤 역할을 했나요?
A5: Cas9 단백질의 세포 내 위치를 형광현미경으로 확인하기 위해 GFP를 융합하여 사용하였습니다.
Q6: 향후 어떤 응용이 기대되나요?
A6: A. niger의 대사경로 개량, 고효율 단백질 생산, 신약 후보 물질 생성 등 산업적 응용이 활발히 진행될 수 있습니다.

용어 설명

CRISPR/Cas9: 특정 유전자 영역을 자르고 편집할 수 있는 유전체 편집 기술
U6 snRNA promoter: RNA polymerase III에 의해 작동되는 스플라이소좀 RNA 유전자 프로모터로, sgRNA 전사에 사용됨
sgRNA: Cas9 단백질이 타깃 DNA를 인식하게 하는 단일가이드 RNA
albA: Aspergillus niger의 포자 색깔을 결정하는 유전자
Donor DNA: 유전자 삽입 실험에서 삽입될 DNA 조각으로, 상동팔을 포함함
Homologous arms: 유전자 편집 시 대상 유전자와 상동되는 서열 구간
NHEJ: 비상동 말단 연결로, 유전체 손상 복구 메커니즘 중 하나이며 오류 가능성이 높음
HR: 상동 재조합으로, 정확한 유전자 삽입에 사용되는 복구 경로
PanU6: Aspergillus niger에서 유래된 내인성 U6 프로모터
pCas9: Cas9 단백질을 발현시키는 플라스미드