Generation of an mESC model with a human hemophilia B nonsense mutation via CRISPR/Cas9 technology

dijw1412c1 2025. 4. 29.

이 리뷰에서는 Yanchun Ma 외 연구진이 Stem Cell Research & Therapy (2022)에 발표한 논문, "Generation of an mESC model with a human hemophilia B nonsense mutation via CRISPR/Cas9 technology"를 다룹니다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 인간 혈우병 B의 넌센스 돌연변이(F9 c.223C>T)를 가진 생쥐 배아줄기세포(mESC) 모델을 개발하고자 하였습니다. 혈우병 B는 응고인자 IX의 결핍으로 인해 발생하는 희귀한 유전 질환으로, 현재까지 완치가 불가능하며 보충 요법에 의존하고 있습니다. 연구진은 임상에서 관찰된 단일 염기 돌연변이를 기반으로 유전적 편집을 수행하고, 이 돌연변이가 유전자 발현 및 단백질 생성에 어떤 영향을 미치는지를 평가하였습니다. 이 모델은 세포 수준에서 질병 발병 메커니즘을 규명하고 새로운 치료법 개발을 위한 전임상 플랫폼으로 기능할 수 있으며, 특히 넌센스 돌연변이에 대한 치료제 개발 연구에 큰 도움이 됩니다.

연구 배경 및 중요성

혈우병 B는 X 염색체에 위치한 F9 유전자의 결함으로 인해 발생하는 희귀 유전질환입니다. 기존 치료는 응고인자 IX의 보충이지만, 중화항체 발생, 높은 비용, 반복 투여의 필요성 등의 문제로 인해 완전한 해결책이 되지 못합니다. 특히 넌센스 돌연변이는 전체 혈우병 B 유전자 변이의 약 8%를 차지하며, 응고인자 저항성 항체의 형성과도 연관되어 있습니다. 현재 진행 중인 넌센스 돌연변이 치료 전략에는 리드스루(read-through) 약물 등이 있지만, 이에 대한 기초적인 질병 모델 연구가 부족한 상황입니다. 따라서 임상적으로 관찰되는 단일 염기 돌연변이를 기반으로 하는 mESC 모델 개발은 매우 중요한 의의를 가집니다.

연구 목적 및 배경

이 연구의 주요 목적은 인간 환자에게서 발견된 F9 c.223C>T(p.R75X) 넌센스 돌연변이를 도입한 생쥐 배아줄기세포 모델을 생성하는 것입니다. 이를 통해 해당 돌연변이가 줄기세포의 분화능, 유전자 발현 및 단백질 합성에 미치는 영향을 분석하고, 궁극적으로 넌센스 돌연변이에 기반한 혈우병 B의 병태생리를 이해하고 치료 전략을 개발하는 데 필요한 모델 시스템을 제공하고자 했습니다.

연구 방법

F9 유전자의 c.223C>T 돌연변이를 포함한 donor 플라스미드 및 sgRNA 설계
Plasmid를 mESC에 전기천공하여 유전자 편집 수행
Puromycin과 적색 형광 단백질을 이용해 돌연변이 클론 선별
qRT-PCR 및 면역염색을 통한 줄기세포 특성 검증
EB 및 간세포 유사 세포로의 분화를 통해 기능성 평가

연구진은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 F9 유전자 내 넌센스 돌연변이를 유도하였으며, 전기천공 후 항생제 및 형광 기반 선별을 통해 성공적으로 변이 세포주를 확립했습니다. 이후 세포의 형태, 염색체 정상성, 다분화능 및 유전자 발현 등을 통해 모델의 적합성을 검증했습니다.

주요 발견 및 결과

연구를 통해 생성된 E14-mF9-27# 세포주는 F9 유전자에 단일 염기 돌연변이를 포함하고 있으며, 염색체 이상이 없고 줄기세포로서의 특성(Oct4, Nanog 등 발현)을 유지하고 있었습니다. 이 세포주는 EB 및 간세포 유사 세포로의 분화 능력을 지니며, 분화 후 F9 유전자의 RNA 및 단백질 발현이 WT 대비 현저히 감소했습니다. 이는 해당 돌연변이가 유전자 전사 및 번역에 직접적인 영향을 미침을 보여주며, 임상 환자의 표현형과 유사한 결과입니다.

실험 결과 요약

항목	결과
F9 c.223C>T 돌연변이 성공 여부	E14-mF9-27# 클론에서 확인됨
줄기세포 마커 (Oct4, Nanog 등)	mRNA 및 단백질 수준에서 모두 발현
삼배엽 분화 능력	EB 형성 후 각 배엽 마커 유의미하게 발현
간세포 유사세포로의 분화	형태학적 변화 및 ALB 발현 확인
F9 유전자 발현 (분화 후)	WT-Hep에서는 발현, Mu-Hep에서는 발현되지 않음

표에서 보듯이, 돌연변이 세포주는 줄기세포로서의 특성과 분화능을 보존하면서도, F9 유전자의 기능 손실을 명확히 보여줍니다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 연구는 매우 정교한 유전자 편집 모델을 제공하였지만, 몇 가지 한계도 존재합니다. 첫째, in vitro 분화 효율이 낮아 간세포 성숙도가 충분하지 않았으며, 이는 마커 발현량 감소로 나타났습니다. 둘째, 이 모델은 단일 돌연변이만을 반영하기 때문에, 다른 종류의 돌연변이 모델과의 비교 연구가 필요합니다. 향후에는 해당 세포주를 이용한 키메라 마우스 생성, 약물 스크리닝 플랫폼 활용, 리드스루 약물 반응성 테스트 등이 고려될 수 있습니다.

결론

본 논문은 인간 혈우병 B 환자에게서 발견된 F9 c.223C>T 넌센스 돌연변이를 포함한 생쥐 배아줄기세포 모델을 성공적으로 구축하였습니다. 이 모델은 유전자 결실이나 삽입 없이 단일 염기 변이만을 가지며, 세포 분화 및 성장에 영향을 주지 않으면서도 F9 유전자 기능에는 명확한 영향을 주는 이상적인 질병 모델입니다. 향후 넌센스 돌연변이에 기반한 치료 전략 연구의 기반이 될 수 있는 매우 유용한 자원으로 평가됩니다.

개인적인 생각

이 논문은 질병 특이적 돌연변이를 반영한 정밀 모델 시스템 개발의 대표적인 예라 할 수 있습니다. 기존의 유전자 결실 기반 모델이 병의 전체적인 메커니즘을 설명하기에 한계가 있었던 반면, 본 연구는 실제 임상에서 관찰되는 단일 염기 돌연변이를 반영함으로써 더욱 실제에 가까운 연구가 가능하게 하였습니다. 특히, 줄기세포 특성을 유지하면서도 특정 유전자의 기능만을 선택적으로 차단했다는 점은 매우 뛰어난 전략입니다. 이러한 접근은 향후 리드스루 약물 반응성, 유전자 복구 전략, RNA 안정성 조절 기전 등 다양한 연구에 기반이 될 수 있습니다. 전임상 연구뿐 아니라 약물 개발 단계에서도 활용될 수 있는 가치 있는 성과라고 생각합니다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1: F9 c.223C>T 돌연변이는 어떤 영향을 미치나요?
A1: 이 돌연변이는 넌센스 돌연변이로, 조기 종결 코돈을 유발하여 F9 유전자 전사 및 번역을 저해합니다.
Q2: 이 세포주는 임상 환자와 얼마나 유사한가요?
A2: 임상 환자에게서 관찰된 단일 염기 변이와 동일한 변이를 포함하고 있어 표현형이 매우 유사합니다.
Q3: 세포의 다분화능은 유지되나요?
A3: 네, Oct4, Nanog 등의 마커 발현 및 EB 분화를 통해 삼배엽으로의 분화 능력이 확인되었습니다.
Q4: 간세포 유사세포로의 분화는 성공적이었나요?
A4: ALB 발현 등 간세포 마커는 확인되었지만, 성숙도는 낮아 추가 개선이 필요합니다.
Q5: 이 모델의 활용 범위는 어떻게 되나요?
A5: 넌센스 돌연변이 병태생리 연구, 리드스루 약물 반응 분석, 유전자 복원 치료 전략 개발 등에 활용될 수 있습니다.
Q6: CRISPR/Cas9의 오프타겟 문제는 없었나요?
A6: sgRNA3를 사용했을 때, 사전에 예측된 오프타겟 부위에서 이상이 발견되지 않았습니다.

용어 설명

혈우병 B: F9 유전자의 결함으로 인해 발생하는 유전적 출혈 질환
F9: 응고인자 IX를 암호화하는 유전자
넌센스 돌연변이: 조기 종결 코돈을 형성하여 단백질 생성이 중단되는 유전자 변이
CRISPR/Cas9: 특정 DNA를 절단해 유전자 편집을 가능하게 하는 기술
mESC: 생쥐 배아줄기세포로, 다분화능과 자기재생능을 가짐
EB (Embryoid Body): 배아줄기세포가 분화할 수 있도록 형성되는 3차원 구조체
ALB (Albumin): 간세포에서 특이적으로 발현되는 단백질
Read-through 치료: 조기 종결 코돈을 우회하여 정상 단백질 합성을 유도하는 치료 방식
Puromycin: 단백질 합성을 방해하는 항생제로, 유전자 편집 세포 선별에 사용
LoxP: 특정 DNA 구간을 절단하거나 재조합하는 데 사용되는 염기서열