Development and application of a rapid all-in-one plasmid CRISPR-Cas9 system for iterative genome editing in Bacillus subtilis

dijw1412c1 2025. 5. 11.

이번 블로그 글에서는 Bacillus subtilis의 반복적 유전체 편집(iterative genome editing)을 위해 개발된 신속한 올인원(all-in-one) CRISPR-Cas9 시스템에 대한 연구를 소개한다. 전통적인 이중 플라스미드 시스템은 유전자 제거 후 플라스미드 제거와 재도입이 필요한 번거로움이 있지만, 본 연구는 단일 플라스미드를 기반으로 플라스미드 자가 제거(self-curing) 모듈을 포함한 혁신적인 시스템을 구축하여 유전체 편집 주기를 대폭 단축하였다. 특히 PEG4000을 활용한 PAMPL(PEG4000-assisted monomer plasmid ligation) 기법은 고분자량 플라스미드의 형질전환 효율을 높여, B. subtilis에서의 유전자 삽입, 삭제, 점 돌연변이 모두 높은 효율로 구현하였다. 이 시스템은 단 한 번의 플라스미드 도입과 제거만으로 빠르게 반복적인 유전체 조작이 가능하며, 유전자 편집 주기를 2.5일로 단축시키는 데 성공하였다. 또한 응용 사례로 Douchi 섬유소분해효소(DFE27)를 생산하는 유전공학 균주를 제작하여 산업적 활용 가능성까지 입증하였다.

연구 배경 및 중요성

Bacillus subtilis는 산업용 효소 생산에서 널리 활용되는 미생물이며, 그 유전체 편집을 통해 생산 능력을 향상시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 기존의 CRISPR-Cas9 기반 유전체 편집은 대부분 이중 플라스미드 시스템에 의존하며, 플라스미드 제거와 재도입을 반복해야 하므로 시간과 노력이 많이 든다. 특히 반복적인 유전체 편집이 요구되는 합성생물학이나 대사공학 분야에서는 이러한 비효율성이 큰 장애가 된다. 따라서, 편집과 자가 제거가 동시에 가능한 올인원 시스템의 개발은 높은 실용성과 파급력을 지닌다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 주요 목적은 반복적인 유전체 편집이 가능하고, 고효율적이며, 빠르게 작동하는 CRISPR-Cas9 시스템을 Bacillus subtilis에 구축하는 것이다. 이를 위해 플라스미드 내에 Cas9, 타깃 sgRNA, 자가 제거 sgRNA를 포함하는 단일 플라스미드를 설계하고, 이를 통해 유전자의 삽입, 제거, 점 변이 등을 반복적으로 구현할 수 있는 시스템을 구축하고자 하였다.

연구 방법

Cas9, gRNAtarget, gRNArep를 포함하는 올인원 플라스미드 제작
gRNArep는 플라스미드 복제기(repA)를 표적으로 하며, 유도 가능한 PacoR 프로모터에 의해 발현됨
PAMPL 기법을 이용해 고분자량 플라스미드를 멀티머 형태로 형질전환
유전자 편집 후 자가 제거 유도하여 다음 라운드 편집 준비
epr, bpr 유전자를 제거하고 DFE27 단백질 발현 실험 진행

형질전환 효율 향상을 위해 PEG4000을 활용하여 단일 플라스미드를 멀티머 형태로 조립하였고, sgRNArep는 acetoin으로 유도 가능한 프로모터로 조절하여 플라스미드 자가 제거를 유도하였다. gRNAtarget은 PglyA에 의해 항상 발현되며, Cas9은 PliaI에 의해 발현되었다.

주요 발견 및 결과

본 시스템은 유전자의 삽입, 제거, 점 변이에 대해 각각 96%, 100%, 100%의 편집 효율을 보였으며, 플라스미드 자가 제거 효율은 90% 이상이었다. PAMPL 기법을 활용한 플라스미드 멀티머 조립은 기존 방법 대비 형질전환 효율을 수백 배 향상시켰으며, 실제 편집된 클론의 100%에서 타깃 유전자의 변형이 확인되었다. 또한, epr과 bpr 유전자 제거 후 도우치 섬유소분해효소를 발현시킨 결과, 야생형 대비 최대 11.5% 증가된 효소 활성을 나타냈다.

실험 결과 요약

편집 유형	편집 효율	플라스미드 자가 제거 효율
erm 유전자 제거	100% (32/32)	95.8%
amyE 유전자 제거	100% (32/32)	91.6%
spo0A 점 변이	100% (660/660)	97.9%
EGFP 삽입	93.8%	95.8%

이러한 결과는 시스템의 높은 안정성과 정밀도를 나타내며, 반복 유전체 편집에 매우 적합함을 입증한다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 연구는 B. subtilis에 한정된 시스템을 제시하고 있으며, 다른 종으로의 확장 가능성은 아직 검증되지 않았다. 또한, 단일 시스템에서의 다중 유전자 동시 편집 가능성, 더 복잡한 대사경로 재설계를 위한 응용 등은 향후 연구를 통해 확장되어야 할 부분이다. PAMPL 기법의 표준화 및 자동화, 보다 강력한 유도형 프로모터 개발도 유용할 것이다.

결론

연구진은 기존의 반복 유전체 편집 한계를 극복할 수 있는 고속 CRISPR-Cas9 기반 올인원 시스템을 성공적으로 개발하였다. 단 한 번의 플라스미드 도입과 제거만으로 반복적인 유전자 편집이 가능하며, 실제 산업 응용 가능성까지 제시하였다. 본 시스템은 향후 미생물 세포 공장 구축 및 합성생물학 응용에 강력한 도구로 자리매김할 수 있을 것이다.

개인적인 생각

이 연구는 단순한 편집 효율 향상을 넘어, 유전체 편집 프로세스 전반의 효율성과 실용성을 고려한 시스템 설계라는 점에서 매우 인상적이다. 특히 플라스미드 자가 제거를 유도하는 gRNArep 모듈과 PAMPL 기법의 결합은 실제 실험실 환경에서의 편집 시간과 자원을 획기적으로 절약해준다. 또한, 이 시스템을 통해 Douchi fibrinolytic enzyme의 생산 효율이 개선되었다는 결과는, 산업 효소 생산에 직접 응용될 수 있는 가능성을 보여준다. 향후 이 시스템이 다양한 미생물에 적용된다면, 합성생물학의 Design-Build-Test-Learn 사이클을 대폭 단축할 수 있을 것으로 기대된다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1: PAMPL 기법이란 무엇인가요?
A1: PEG4000을 활용하여 단일 플라스미드를 멀티머 형태로 결합시켜 형질전환 효율을 높이는 기법입니다.
Q2: gRNArep는 어떤 역할을 하나요?
A2: 플라스미드의 복제기를 타겟으로 하여 편집 후 플라스미드를 자가 제거하는 역할을 합니다.
Q3: 반복적인 유전체 편집이 왜 중요한가요?
A3: 대사 경로 재설계나 합성생물학 응용에서는 여러 유전자를 차례로 수정해야 하므로 반복적 편집이 필요합니다.
Q4: 플라스미드 제거는 어떻게 유도되나요?
A4: acetoin을 첨가하여 PacoR 프로모터를 활성화시키고, 이로 인해 gRNArep가 발현되어 플라스미드가 제거됩니다.
Q5: 이 시스템은 다른 종에도 사용할 수 있나요?
A5: 이론적으로 가능하지만, 플라스미드 복제기나 프로모터의 종 특이성 때문에 추가적인 최적화가 필요합니다.
Q6: 편집 주기 2.5일이란 어떤 의미인가요?
A6: 플라스미드 도입, 유전자 편집, 플라스미드 제거까지 한 사이클을 마치는 데 평균 2.5일이 걸린다는 의미입니다.

용어 설명

CRISPR-Cas9: 유전자 편집을 위해 RNA 가이드와 Cas9 효소를 활용하는 시스템으로, 특정 DNA 서열을 절단할 수 있다.
gRNAtarget: 목표 유전자를 인식하여 Cas9이 해당 부위를 절단하도록 유도하는 sgRNA.
gRNArep: 플라스미드 자가 제거를 위해 복제기(repA)를 타겟으로 하는 sgRNA.
PliaI: 바시트라신에 의해 유도되는 프로모터로 Cas9 유전자 발현에 사용되었다.
PacoR: acetoin에 의해 유도되며 gRNArep의 발현을 조절하는 프로모터.
PAMPL: PEG4000을 이용한 플라스미드 멀티머화 방법으로 형질전환 효율을 향상시킴.
DFE27: 도우치 섬유소분해효소로, 혈전 용해 효과가 있는 단백질이다.
ERM: 에리스로마이신 항생제 저항성 유전자.
amyE: α-아밀라아제 유전자로, 전분 분해에 관여한다.
spo0A: 포자 형성을 조절하는 핵심 전사 인자 유전자.